Difracción de Macromoléculas
Cuando los rayos X alcanzan un átomo interaccionan con sus electrones exteriores. Éstos reemiten la radiación electromagnética incidente en diferentes direcciones. Los rayos X reemitidos desde átomos correspondientes dentro del cristal interfieren entre sí destructiva o constructivamente y esto genera los puntos del patrón de difracción. Solo cuando los rayos difractados interactúan constructivamente se pueden ver los puntos de difracción y esto sucede cuando se cumple la Ley de Bragg nλ=2dSenθ.
En un experimento de difracción conocemos el valor de la longitud de onda y el ángulo del rayo difractado, pero desconocemos el valor de “d” que depende de la disposición de los planos dentro del cristal que a su vez dependen de la simetría que relaciona a la Unidad Asimétrica: la proteína. Para calcular el mapa de densidad electrónica a partir del patrón de difracción se utiliza una transformada inversa de Fourier, la descomposición de una señal en componentes de frecuencias diferentes, que necesita de dos datos: La intensidad de la difracción y la fase de los rayos difractados. La primera se mide experimentalmente con un detector de rayos X, sin embargo la segunda no se puede determinar tan fácilmente, ello representa un problema: el problema de fases.
La Colecta de Datos de Difracción.
La difracción de cristales con rayos X se puede realizar en dos fuentes de radiación conocidas como ánodo rotatorio y sincrotrón. La primera, también llamada “de casa”, es menos intensa y tiene una longitud de onda fija, en cambio la Fuente Sincrotrón es mucho más intensa y además se puede modular la longitud de onda de los rayos X.
Durante la medición de difracción de rayos X, el cristal es montado en un goniómetro (instrumento de medición con base circular que permite colocar a un cristal en un ángulo definido) y se rota gradualmente mientras es bombardeado con rayos X, produciendo un patrón regularmente espaciado de puntos llamado Patrón de Difracción. Un patrón de difracción completo consta de una serie de marcos (frames en inglés) o imágenes en dos dimensiones tomados a diferentes valores de rotación del cristal utilizando un detector sensible a los rayos X. La cantidad de estos marcos necesarios para determinar la estructura de una proteína depende de la simetría del cristal, es decir, del grupo espacial. Una vez colectados todos los marcos se integran los valores de la intensidad (I) y de la desviación estándar de la intensidad (I/sigma(I)) de cada uno de los puntos de difracción en un mismo archivo.
Métodos para resolver el problema de fase.
La técnica más utilizada para resolver el problema de fase se denomina Reemplazo Molecular (RM). En este método es necesaria la existencia de una estructura homóloga a la que se quiere determinar y se utiliza como modelo de búsqueda para calcular las fases. El modelo es rotado y trasladado dentro de una celda que tiene los parámetros calculados experimentalmente a partir de la difracción del cristal. Para cada valor de rotación y traslación se calcula un patrón de difracción teórico y se compara con el experimental, hasta que coincidan. Los valores de fases calculadas de esta manera son aproximadas, pero permiten generar un mapa de densidad electrónica inicial y conforme se construye el modelo de la proteína las fases se recalculan y mejora el mapa, permitiendo construir un modelo más detallado que a su vez aporta mejores valores de fase.
También existe la técnica llamada Dispersión Anómala a Múltiple longitud de onda (MAD, por sus siglas en inglés de Multiple Anomalous Dispersion) y una variante que utiliza una sola longitud de onda (SAD). Para resolver el problema por este método, se usa la señal que emiten ciertos átomos pesados a determinadas longitudes de onda de rayos X, esta señal se denomina “señal anómala”. Una ventaja que presenta este método es que no es necesario usar un modelo de búsqueda, es decir: las fases se calculan a partir de las posiciones de los átomos pesados y la proteína se construye de novo.
En una fuente sincrotrón se puede cambiar la longitud de onda, y esto permite hacer experimentos de MAD, pues es necesario colectar, al menos, tres conjuntos de datos a diferentes longitudes de onda de los rayos X; una donde el átomo pesado absorbe los rayos X, una menor y otra mayor a este valor. Si la señal del átomo es buena, en el punto donde absorbe los rayos X, y se pueden determinar su posición dentro del cristal, es suficiente para determinar las fases de la proteína y poder trazar sus átomos. Mientras que para MAD se necesitan colectar tres conjuntos de datos, en SAD, sólo es necesario uno, en donde el átomo pesado absorbe los rayos X. Sin embargo, para poder extraer la señal anómala de algún átomo, se necesitan datos de mejor calidad que para el caso de RM, principalmente: multiplicidad de datos mayor de 4, el doble de grados colectados y alta resolución para usarla en los últimos pasos de afinamiento. El átomo más usado para MAD/SAD es el selenio; que se sustituye por el azufre de las metioninas. Para ello es necesario expresar la proteína en un organismo que no pueda sintetizar la metionina o inhibir su vía de síntesis y usar un medio que contenga seleniometionina; de esta manera, la seleniometionina es incorporada a las proteínas en vez de la metionina con azufre. Las proteínas con seleniometionina son más sensibles a la oxidación y usualmente son más hidrofóbicas y por lo tanto menos solubles.
Otras técnicas para resolver el problema de fase son las de Reemplazo Isomorfo Múltiple (MIR) y Reemplazo Isomorfo Simple (SIR) que se basan en el siguiente principio: si se tienen dos cristales, uno de la proteína sola (cristal nativo) y otro de la proteína con átomos pesados unidos o incorporados, y se colectan datos de difracción de ambos, la diferencia en las intensidades de las difracciones será reflejo de la contribución de los átomos pesados a dicha intensidad. Esto porque los diferentes átomos contribuyen a la intensidad en proporción al cuadrado del número de electrones que tiene. Esta diferencia se puede usar para identificar a los átomos pesados, a partir de un mapa de Patterson, y puesto que estos siempre serán mucho menos que los de la proteína, es más fácil tratar de encontrar sus fases y con ello sus posiciones. Una vez que se conocen las fases de los átomos pesados, estas se aplican a la difracción del cristal nativo para obtener las fases de los átomos de la proteína. Usualmente es necesario tener más de una derivada metálica (cristal con átomos pesados unidos) para poder resolver las fases por esta técnica, sin embargo, si una derivada es lo suficientemente buena, es decir, que por sí misma aporte información suficiente para conocer las fases de la proteína, entonces no se necesitan más.
Afinamiento de la estructura.
Una vez que se ha resuelto el problema de fase se procede al Afinamiento de la estructura. En este paso se calculan mapas de densidad electrónica en donde se ajusta el modelo. También se añaden las moléculas de agua y otros ligantes que se puedan ver en la densidad electrónica que no pertenezca a la proteína. Para evaluar que el modelo está correctamente ajustado a la densidad electrónica se monitorean los valores de R y R free que son indicativos del margen de error y se permiten valores alrededor del 20%.
En un experimento de difracción conocemos el valor de la longitud de onda y el ángulo del rayo difractado, pero desconocemos el valor de “d” que depende de la disposición de los planos dentro del cristal que a su vez dependen de la simetría que relaciona a la Unidad Asimétrica: la proteína. Para calcular el mapa de densidad electrónica a partir del patrón de difracción se utiliza una transformada inversa de Fourier, la descomposición de una señal en componentes de frecuencias diferentes, que necesita de dos datos: La intensidad de la difracción y la fase de los rayos difractados. La primera se mide experimentalmente con un detector de rayos X, sin embargo la segunda no se puede determinar tan fácilmente, ello representa un problema: el problema de fases.
La Colecta de Datos de Difracción.
La difracción de cristales con rayos X se puede realizar en dos fuentes de radiación conocidas como ánodo rotatorio y sincrotrón. La primera, también llamada “de casa”, es menos intensa y tiene una longitud de onda fija, en cambio la Fuente Sincrotrón es mucho más intensa y además se puede modular la longitud de onda de los rayos X.
Durante la medición de difracción de rayos X, el cristal es montado en un goniómetro (instrumento de medición con base circular que permite colocar a un cristal en un ángulo definido) y se rota gradualmente mientras es bombardeado con rayos X, produciendo un patrón regularmente espaciado de puntos llamado Patrón de Difracción. Un patrón de difracción completo consta de una serie de marcos (frames en inglés) o imágenes en dos dimensiones tomados a diferentes valores de rotación del cristal utilizando un detector sensible a los rayos X. La cantidad de estos marcos necesarios para determinar la estructura de una proteína depende de la simetría del cristal, es decir, del grupo espacial. Una vez colectados todos los marcos se integran los valores de la intensidad (I) y de la desviación estándar de la intensidad (I/sigma(I)) de cada uno de los puntos de difracción en un mismo archivo.
Métodos para resolver el problema de fase.
La técnica más utilizada para resolver el problema de fase se denomina Reemplazo Molecular (RM). En este método es necesaria la existencia de una estructura homóloga a la que se quiere determinar y se utiliza como modelo de búsqueda para calcular las fases. El modelo es rotado y trasladado dentro de una celda que tiene los parámetros calculados experimentalmente a partir de la difracción del cristal. Para cada valor de rotación y traslación se calcula un patrón de difracción teórico y se compara con el experimental, hasta que coincidan. Los valores de fases calculadas de esta manera son aproximadas, pero permiten generar un mapa de densidad electrónica inicial y conforme se construye el modelo de la proteína las fases se recalculan y mejora el mapa, permitiendo construir un modelo más detallado que a su vez aporta mejores valores de fase.
También existe la técnica llamada Dispersión Anómala a Múltiple longitud de onda (MAD, por sus siglas en inglés de Multiple Anomalous Dispersion) y una variante que utiliza una sola longitud de onda (SAD). Para resolver el problema por este método, se usa la señal que emiten ciertos átomos pesados a determinadas longitudes de onda de rayos X, esta señal se denomina “señal anómala”. Una ventaja que presenta este método es que no es necesario usar un modelo de búsqueda, es decir: las fases se calculan a partir de las posiciones de los átomos pesados y la proteína se construye de novo.
En una fuente sincrotrón se puede cambiar la longitud de onda, y esto permite hacer experimentos de MAD, pues es necesario colectar, al menos, tres conjuntos de datos a diferentes longitudes de onda de los rayos X; una donde el átomo pesado absorbe los rayos X, una menor y otra mayor a este valor. Si la señal del átomo es buena, en el punto donde absorbe los rayos X, y se pueden determinar su posición dentro del cristal, es suficiente para determinar las fases de la proteína y poder trazar sus átomos. Mientras que para MAD se necesitan colectar tres conjuntos de datos, en SAD, sólo es necesario uno, en donde el átomo pesado absorbe los rayos X. Sin embargo, para poder extraer la señal anómala de algún átomo, se necesitan datos de mejor calidad que para el caso de RM, principalmente: multiplicidad de datos mayor de 4, el doble de grados colectados y alta resolución para usarla en los últimos pasos de afinamiento. El átomo más usado para MAD/SAD es el selenio; que se sustituye por el azufre de las metioninas. Para ello es necesario expresar la proteína en un organismo que no pueda sintetizar la metionina o inhibir su vía de síntesis y usar un medio que contenga seleniometionina; de esta manera, la seleniometionina es incorporada a las proteínas en vez de la metionina con azufre. Las proteínas con seleniometionina son más sensibles a la oxidación y usualmente son más hidrofóbicas y por lo tanto menos solubles.
Otras técnicas para resolver el problema de fase son las de Reemplazo Isomorfo Múltiple (MIR) y Reemplazo Isomorfo Simple (SIR) que se basan en el siguiente principio: si se tienen dos cristales, uno de la proteína sola (cristal nativo) y otro de la proteína con átomos pesados unidos o incorporados, y se colectan datos de difracción de ambos, la diferencia en las intensidades de las difracciones será reflejo de la contribución de los átomos pesados a dicha intensidad. Esto porque los diferentes átomos contribuyen a la intensidad en proporción al cuadrado del número de electrones que tiene. Esta diferencia se puede usar para identificar a los átomos pesados, a partir de un mapa de Patterson, y puesto que estos siempre serán mucho menos que los de la proteína, es más fácil tratar de encontrar sus fases y con ello sus posiciones. Una vez que se conocen las fases de los átomos pesados, estas se aplican a la difracción del cristal nativo para obtener las fases de los átomos de la proteína. Usualmente es necesario tener más de una derivada metálica (cristal con átomos pesados unidos) para poder resolver las fases por esta técnica, sin embargo, si una derivada es lo suficientemente buena, es decir, que por sí misma aporte información suficiente para conocer las fases de la proteína, entonces no se necesitan más.
Afinamiento de la estructura.
Una vez que se ha resuelto el problema de fase se procede al Afinamiento de la estructura. En este paso se calculan mapas de densidad electrónica en donde se ajusta el modelo. También se añaden las moléculas de agua y otros ligantes que se puedan ver en la densidad electrónica que no pertenezca a la proteína. Para evaluar que el modelo está correctamente ajustado a la densidad electrónica se monitorean los valores de R y R free que son indicativos del margen de error y se permiten valores alrededor del 20%.
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