Cristalografía de Rayos X
La cristalografía de rayos X es un método que permite determinar el arreglo tridimensional de los átomos dentro de un cristal. Los rayos X son una forma de radiación electromagnética de alta energía y pequeña longitud de onda, del orden del tamaño de los átomos, de tal manera que puede interactuar con ellos. Cuando un haz de rayos X incide sobre un cristal difracta en direcciones específicas y genera un patrón de difracción que depende de la simetría interna del cristal. A partir del ángulo y de la intensidad de estos rayos difractados se puede reproducir una imagen tridimensional de la densidad de los electrones dentro del cristal y a partir de esta densidad se puede determinar la posición promedio de los átomos, sus enlaces químicos, su desorden relativo y alguna otra información dependiendo de la calidad de los cristales y de su difracción.
Para determinar la estructura de una proteína, primero se debe obtener un cristal de ella que difracte con la calidad suficiente para hacer estudios de difracción de rayos X, posteriormente se debe colectar un patrón de difracción completo y resolver el problema de fases, esto es, conocer de qué punto del espacio (dentro del cristal) proviene cada rayo X difractado. Después se debe generar un mapa de densidad electrónica a partir de la cual se construirá el modelo tridimensional de la proteína.
Cristalización de la proteína.
Para obtener un cristal de proteína es necesario tener una muestra de dicha proteína altamente pura y que haya sido manipulada lo menos posible ya que durante el trayecto de su purificación algunas proteínas pueden perder algunas de las propiedades necesarias para su función biológica. Una vez que la proteína ha sido purificada en homogeneidad, se debe colocar en un sistema cerrado de tal manera que conforme alcance su estado de equilibrio vaya ordenando a las moléculas de proteína para formar el cristal. La cristalización es en gran medida un procedimiento de ensayo y error en el que la proteína es precipitada de manera lenta y ordenada.
Dentro de los métodos de cristalización de proteínas más usados se encuentra el de difusión de vapor en gota colgante. En este método, se coloca una pequeña muestra de la proteína pura (típicamente uno o dos microlitros de proteína a alta concentración) en un cubre objetos previamente siliconizado para favorecer la cohesión molecular y formar una gota semiesférica en vez de una gota esparcida por el cristal. Esta gota con proteína se mezcla con un volumen igual de líquido precipitante, de esta manera ambos quedan diluidos por la mitad. Dentro del mismo sistema se coloca un volumen mucho mayor (típicamente un mililitro) de líquido precipitante que funciona como reservorio y contra el cual se equilibrará la gota con proteína-precipitante. Una variante de este método es el de difusión de vapor en gota apoyada en donde la muestra de proteína-precipitante se coloca en un “puente”, permitiendo así que la gota sea mucho más grande, retardando el tiempo que tardará en equilibrarse con el reservorio. Otra variante de este método es el de difusión de vapor tipo sándwich en donde la muestra de proteína-precipitante se coloca en medio de dos porta objetos ligeramente separados, de esta manera se reduce significativamente la superficie expuesta por la que la gota equilibrará con el reservorio.
Otros métodos para cristalizar involucran diálisis, en donde se puede usar un gradiente de fuerza iónica como agente precipitante a través de una membrana de diálisis, aceites para reducir aún más la velocidad de equilibrio del sistema, entre otros, de tal forma que cada método favorecerá una velocidad diferente de equilibrio del sistema. La función del líquido precipitante es siempre llevar a la proteína del estado soluble a uno de supersaturación para que se pueda dar el crecimiento de cristales; su naturaleza y concentración serán diferentes para cada proteína y no es posible saber de antemano cuál precipitante y a qué concentración cristalizará una proteína determinada.
El Diagrama de Fases.
Para obtener cristales grandes, es necesario encontrar condiciones donde aparezcan pocos cristales en la gota; de esta manera, la proteína soluble estará disponible para que los cristales crezcan, en vez de ser usada para formar más cristales. Para conocer estas condiciones, es necesario valerse de lo que se conoce como Diagrama de Fases. En este diagrama se representa un gradiente de concentración de precipitante contra un gradiente de concentración de proteína. En él destacan cuatro zonas o fases: la fase soluble es la región de la gráfica en donde la proteína se mantiene soluble dentro de un rango de concentración de precipitante. La fase de crecimiento (o metaestable) es la zona en la que se ve más favorecido el crecimiento del cristal. En la fase de nucleación, la concentración de ambos componentes es tal, que lo que se ve favorecido es la formación de núcleos de cristalización. Por último, está la fase de precipitado, que es donde las concentraciones de precipitante y proteína son tan altas que ésta última precipita. El diagrama es específico para cada proteína y para cada precipitante, y no es extrapolable a otros casos.
Obtener un diagrama de fase completo para una determinada proteína puede llegar a ser muy laborioso y se consume mucha proteína, sobre todo para determinar los límites entre la zona soluble la zona metaestable, sin embargo, se puede hacer lo que se denomina un diagrama de fases de trabajo. En este diagrama sólo se determinan los límites entre la zona de nucleación y la metaestable. Para conseguir esto se hace un seguimiento de las concentraciones de precipitante, desde las que favorecen la aparición de muchos microcristales hasta donde la gota permanece soluble, a una alta concentración de proteína.
Los cristales de proteína, a diferencia de los cristales de sal o de moléculas pequeñas, son muy sensibles a la manipulación, a la deshidratación y a los cambios de temperatura, por lo que se debe tener mucho cuidado al trabajar con ellos. Para manipularlos se usan loops o asas fabricados con materiales orgánicos que minimizan el impacto al tocarlos.
Los Cristales y su Simetría.
Una característica muy importante de los cristales es que tienen simetrías, de tal manera que realizando operaciones de rotación o traslación determinados se puede reconstruir el cristal. La repetición periódica por la que se describe la estructura interna de los cristales viene representada por un conjunto de traslaciones en las tres direcciones del espacio, de tal forma que el cristal puede considerarse como un apilamiento, en tres dimensiones, de bloques idénticos llamados Celdas Unitarias. Su tamaño viene determinado por la longitud de sus tres aristas (a, b, c), y la forma por el valor de los ángulos entre dichas aristas (alfa, beta, gama: α, β, γ).
Sin embargo, las proteínas no tienen formas que se puedan definir con estos valores, entonces ¿cómo es que las proteínas forman cristales? Dentro de la celda unitaria existen elementos o motivos a lo que se les puede aplicar operadores de simetría para reconstruir la celda, estos motivos se conocen como Unidad Asimétrica y en cristalografía de proteínas esta unidad asimétrica esta compuesta por la proteína, ya sea en estado monomérico o multimérico.
El conjunto de operadores simétricos que son aplicados a la unidad asimétrica para reconstruir la celda se denomina Grupo Espacial. En cristalografía de proteínas existen 230 grupos espaciales y su determinación correcta es crucial para la resolución de la estructura.
Continúa en Difracción de cristales de macromoléculas
Para determinar la estructura de una proteína, primero se debe obtener un cristal de ella que difracte con la calidad suficiente para hacer estudios de difracción de rayos X, posteriormente se debe colectar un patrón de difracción completo y resolver el problema de fases, esto es, conocer de qué punto del espacio (dentro del cristal) proviene cada rayo X difractado. Después se debe generar un mapa de densidad electrónica a partir de la cual se construirá el modelo tridimensional de la proteína.
Cristalización de la proteína.
Para obtener un cristal de proteína es necesario tener una muestra de dicha proteína altamente pura y que haya sido manipulada lo menos posible ya que durante el trayecto de su purificación algunas proteínas pueden perder algunas de las propiedades necesarias para su función biológica. Una vez que la proteína ha sido purificada en homogeneidad, se debe colocar en un sistema cerrado de tal manera que conforme alcance su estado de equilibrio vaya ordenando a las moléculas de proteína para formar el cristal. La cristalización es en gran medida un procedimiento de ensayo y error en el que la proteína es precipitada de manera lenta y ordenada.
Dentro de los métodos de cristalización de proteínas más usados se encuentra el de difusión de vapor en gota colgante. En este método, se coloca una pequeña muestra de la proteína pura (típicamente uno o dos microlitros de proteína a alta concentración) en un cubre objetos previamente siliconizado para favorecer la cohesión molecular y formar una gota semiesférica en vez de una gota esparcida por el cristal. Esta gota con proteína se mezcla con un volumen igual de líquido precipitante, de esta manera ambos quedan diluidos por la mitad. Dentro del mismo sistema se coloca un volumen mucho mayor (típicamente un mililitro) de líquido precipitante que funciona como reservorio y contra el cual se equilibrará la gota con proteína-precipitante. Una variante de este método es el de difusión de vapor en gota apoyada en donde la muestra de proteína-precipitante se coloca en un “puente”, permitiendo así que la gota sea mucho más grande, retardando el tiempo que tardará en equilibrarse con el reservorio. Otra variante de este método es el de difusión de vapor tipo sándwich en donde la muestra de proteína-precipitante se coloca en medio de dos porta objetos ligeramente separados, de esta manera se reduce significativamente la superficie expuesta por la que la gota equilibrará con el reservorio.
Otros métodos para cristalizar involucran diálisis, en donde se puede usar un gradiente de fuerza iónica como agente precipitante a través de una membrana de diálisis, aceites para reducir aún más la velocidad de equilibrio del sistema, entre otros, de tal forma que cada método favorecerá una velocidad diferente de equilibrio del sistema. La función del líquido precipitante es siempre llevar a la proteína del estado soluble a uno de supersaturación para que se pueda dar el crecimiento de cristales; su naturaleza y concentración serán diferentes para cada proteína y no es posible saber de antemano cuál precipitante y a qué concentración cristalizará una proteína determinada.
El Diagrama de Fases.
Para obtener cristales grandes, es necesario encontrar condiciones donde aparezcan pocos cristales en la gota; de esta manera, la proteína soluble estará disponible para que los cristales crezcan, en vez de ser usada para formar más cristales. Para conocer estas condiciones, es necesario valerse de lo que se conoce como Diagrama de Fases. En este diagrama se representa un gradiente de concentración de precipitante contra un gradiente de concentración de proteína. En él destacan cuatro zonas o fases: la fase soluble es la región de la gráfica en donde la proteína se mantiene soluble dentro de un rango de concentración de precipitante. La fase de crecimiento (o metaestable) es la zona en la que se ve más favorecido el crecimiento del cristal. En la fase de nucleación, la concentración de ambos componentes es tal, que lo que se ve favorecido es la formación de núcleos de cristalización. Por último, está la fase de precipitado, que es donde las concentraciones de precipitante y proteína son tan altas que ésta última precipita. El diagrama es específico para cada proteína y para cada precipitante, y no es extrapolable a otros casos.
Obtener un diagrama de fase completo para una determinada proteína puede llegar a ser muy laborioso y se consume mucha proteína, sobre todo para determinar los límites entre la zona soluble la zona metaestable, sin embargo, se puede hacer lo que se denomina un diagrama de fases de trabajo. En este diagrama sólo se determinan los límites entre la zona de nucleación y la metaestable. Para conseguir esto se hace un seguimiento de las concentraciones de precipitante, desde las que favorecen la aparición de muchos microcristales hasta donde la gota permanece soluble, a una alta concentración de proteína.
Los cristales de proteína, a diferencia de los cristales de sal o de moléculas pequeñas, son muy sensibles a la manipulación, a la deshidratación y a los cambios de temperatura, por lo que se debe tener mucho cuidado al trabajar con ellos. Para manipularlos se usan loops o asas fabricados con materiales orgánicos que minimizan el impacto al tocarlos.
Los Cristales y su Simetría.
Una característica muy importante de los cristales es que tienen simetrías, de tal manera que realizando operaciones de rotación o traslación determinados se puede reconstruir el cristal. La repetición periódica por la que se describe la estructura interna de los cristales viene representada por un conjunto de traslaciones en las tres direcciones del espacio, de tal forma que el cristal puede considerarse como un apilamiento, en tres dimensiones, de bloques idénticos llamados Celdas Unitarias. Su tamaño viene determinado por la longitud de sus tres aristas (a, b, c), y la forma por el valor de los ángulos entre dichas aristas (alfa, beta, gama: α, β, γ).
Sin embargo, las proteínas no tienen formas que se puedan definir con estos valores, entonces ¿cómo es que las proteínas forman cristales? Dentro de la celda unitaria existen elementos o motivos a lo que se les puede aplicar operadores de simetría para reconstruir la celda, estos motivos se conocen como Unidad Asimétrica y en cristalografía de proteínas esta unidad asimétrica esta compuesta por la proteína, ya sea en estado monomérico o multimérico.
El conjunto de operadores simétricos que son aplicados a la unidad asimétrica para reconstruir la celda se denomina Grupo Espacial. En cristalografía de proteínas existen 230 grupos espaciales y su determinación correcta es crucial para la resolución de la estructura.
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